Jaren geleden is Gabriel von Eisenstein met zijn vriend Dr. Falke naar een gemaskerd bal geweest, Eisenstein verkleed als vlinder, Falke als vleermuis. Bij die gelegenheid heeft Falke veel te diep in het glaasje gekeken. In plaats van zijn vriend veilig thuis te brengen, heeft Eisenstein hem een loer gedraaid en bij een boom achtergelaten. De volgende ochtend moest Falke in vleermuiskostuum naar huis en werd daarbij uitgelachen door de hele stad. Sindsdien wordt hij door iedereen Dr. Fledermaus genoemd. Jarenlang heeft Falke op wraak gezind, en nu gaat het gebeuren. Met hulp van de puissant rijke Prins Orlofsky heeft Falke een aantal gasten onder valse voorwendselen uitgenodigd voor een groots feest.